【【2017年整理】实时定量PCR步骤】在分子生物学研究中，实时荧光定量PCR（qPCR）是一项广泛应用的技术，用于检测和量化特定DNA或RNA序列的表达水平。它不仅具有高灵敏度和特异性，还能实现对目标基因的精确定量分析。本文将基于2017年的资料整理，详细阐述实时定量PCR的基本步骤与注意事项。

一、实验前准备

1. 引物设计

引物是qPCR成功的关键因素之一。应选择特异性高、扩增效率好的引物对。建议使用在线工具如Primer-BLAST进行引物筛选，并确保其Tm值在58-60℃之间，长度为18-22 bp。

2. 模板制备

根据实验目的选择合适的模板来源，如总RNA或cDNA。对于RNA样本，需先进行逆转录反应生成cDNA，以保证后续PCR的顺利进行。

3. 试剂与仪器校准

确保使用的qPCR试剂（如SYBR Green、TaqMan探针等）在有效期内，并按照说明书要求储存。同时，对PCR仪进行校准，确保温度控制准确。

二、qPCR反应体系配置

1. 反应体积

通常反应体系为20 μL，具体成分如下：

- cDNA模板：2–5 μL

- 正向/反向引物：各0.5 μL（10 μM）

- qPCR Master Mix：10 μL

- 无核酸酶水：补足至20 μL

2. 混匀与离心

反应液配制完成后，轻轻混匀并短暂离心，以确保所有成分充分混合。

三、运行qPCR程序

1. 预变性阶段

多数qPCR仪默认设置为95°C预变性10分钟，以激活Taq酶并使模板完全变性。

2. 循环扩增阶段

包括以下步骤：

- 95°C变性：15秒

- 60°C退火延伸：40秒

- 重复40个循环

3. 熔解曲线分析（可选）

在扩增结束后，进行熔解曲线分析以验证扩增产物的特异性。通过逐步升温并监测荧光信号变化，判断是否存在非特异性扩增或引物二聚体。

四、数据分析

1. Ct值获取

Ct值（Cycle Threshold）是指荧光信号达到设定阈值时的扩增循环数。Ct值越小，表示初始模板量越高。

2. 相对定量计算

常用方法包括2^(-ΔΔCt)法，适用于内参基因稳定的实验。需注意选择合适的内参基因（如GAPDH、β-actin等），并确保其在不同处理组中的表达稳定。

3. 数据可视化

使用软件如Excel、GraphPad Prism或qBase等进行图表绘制，直观展示基因表达差异。

五、常见问题与解决方法

- 扩增效率低：检查引物设计是否合理，优化退火温度。

- 非特异性扩增：增加退火时间或使用TaqMan探针替代SYBR Green。

- 基线噪音高：调整荧光阈值，避免过早检测信号。

六、注意事项

- 每次实验应设置阴性对照（无模板对照）和阳性对照，以排除污染和假阳性。

- 避免多次冻融，保存样品时应分装存放。

- 实验过程中保持操作环境清洁，防止RNA酶污染。

总结：

实时定量PCR作为现代分子生物学的重要工具，其操作流程虽看似简单，但每个环节都需严谨对待。从引物设计到数据分析，每一步都影响最终结果的准确性。随着技术的不断发展，qPCR的应用范围也在不断拓展，为生命科学研究提供了强有力的支持。希望本文能为初学者提供清晰的操作指导，并帮助提高实验的成功率与数据可靠性。